微生物是一类体积微小（目视不可见，需要借助各种显微技术才能观察观测）、结构相对比较简单的生物群体，包括细菌、真菌（非全部）、病毒、古菌和原生生物等多种类型，广泛存在于地球的各种生态圈及动植物体内，和人的生活及生产活动息息相关，也和生物技术及生命科学的发展息息相关。

  微生物数量众多（地球上的微生物数量是天文数字，每克肥沃的土壤中微生物数量即可达几十亿到上百亿；人体皮肤上，每平方厘米也生活着数以十亿级的微生物，有人估计地球上的微生物数量级在十的三十次方，qutta级），种类繁杂（估计有数百万种，每年都有新的微生物品种发现；在2016年，Jay T. Lennon等科学家估计，如果算上细菌和古菌，地球上有万亿级别的物种，已发现的数百万物种只占其中百万分之一，而未发现的品种中，微生物占绝大多数）。

  从以上数据，能够获得显而易见的结论：对微生物种属和菌株鉴定，有着日益重要的意义。

  菌种鉴定是根据微生物样本的不同特征，通过检验测试、对比、匹配等方法，确定微生物的种属，并进一步确定该菌株特性的技术。

  医学、药学和临床诊断：菌种鉴定在医学和临床诊断中起着及其重要的作用，能够在一定程度上帮助确定未知或症状不那么典型的感染病原体，例如细菌、真菌和病毒，以指导适当的治疗方案和控制传染病的传播。研究疾病的发生发展，微生物及其影响也是个重要的考虑环节。在制药工业中，微生物环境的控制也是个重要课题。

  环境监视测定和生态学研究：菌种鉴定在环境监测和生态学研究中发挥着关键作用。通过一系列分析环境样本中的微生物，能了解微生物的多样性、分布和功能，以及它们对环境的影响。

  农业和农产品质量控制：菌种鉴定在农业和农产品质量控制中也有重要应用。它能够适用于检测和鉴定影响农作物和畜禽健康的病原微生物，以采取对应的防治措施。在农牧业生产中，有益微生物的研究，及土壤微生态的研究，也是一个重要方向。

  生物技术和工业应用：菌种鉴定在生物技术和工业应用中具有广泛的应用。能够适用于筛选和鉴定具有特定功能的微生物菌株，例如生产发酵产物、生物降解和生物转化等。

  法医：传统法医生物学中，蝇蛆等昆虫常被用来作为推定死亡时间的依据，而这一些方法并不完美。近些年，研究人员将目光转向了分解死亡动物的细菌和真菌等微生物上，由此产生了微生物法医学。这种基于现代分子生物学技术检验测试样本中的微生物组成及其它特征的方法，具有时间分辨率比较高、模型参数多、计算更精确、可得到额外信息等优势。菌种鉴定是其中最主要的技术。

  矿业及石油业：随着生物技术的发展，微生物在采矿工业及石油开采中作用也十分显著。微生物在找矿、采矿、矿山修复过程都有重要应用，生物学家已经将基因工程技术应用到采矿工业，以提高微生物的效能，并使它们能在更多种类的矿产上发挥其功效。同样的石油开采中有许多生物技术，最主要的是微生物勘探技术和微生物采油技术。显而易见地，涉及微生物应用的领域，菌种鉴定是重要的技术方法和工作内容之一。

  综上，菌种鉴定在医学、食品安全、环境科学、农业和工业等多个领域都具备极其重大的应用价值，对于疾病诊断、食品安全、环境保护和生物技术及各行各业的发展都起到关键的作用。

  细胞形态学：细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容物、革兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式；

  基于检测以上指标的传统的菌种鉴别判定的方法，包括Biolog微生物鉴定系统（代谢指纹），API菌种鉴定系统、Sherlock MIS 微生物菌种鉴定系统等，本质上是基于表型的菌种分类，这些基于形态学和理化指标的传统方法，优点是方法简单，历史悠远长久，可获得菌培养的一些经验和数据积累。但缺点也很明显：周期长，尤其生长慢的菌种；不足够客观和数据化；能准确鉴定的菌种数量有限，对于背景资料了解不多的菌种，有可能力不从心；正迅速地被新技术边缘化从而成为辅助性的检测分型手段；

  鉴于前述微生物研究的重要性和菌种鉴定在微生物研究的重要性，能用于菌种鉴定的方法和技术随着分子生物学技术的进展都得到了应用。分子生物学办法来进行菌株鉴定，本质上是基于对菌株基因的检测以此来实现菌株的分型。所用的技术方法包括：分子杂交，RFLP、RAPD、SSCP，PFGE，基因芯片，q-PCR，基因测序等。

  受益于技术的进步及大规模应用带来的成本下降，DNA测序（基因测序）目前成为菌株鉴定的主流技术之一（另外一个主流及有未来的技术是基于质谱的菌种鉴定）及金标准。测序得到的序列数据，是菌株鉴定最底层因而也是最可靠和最核心的数据，基于基因序列而绘制的分子进化树及和其它种属微生物亲缘关系远近的分析，也能比其它菌种鉴别判定的方法提供更多且有用的信息。

  应用于菌种鉴定的DNA测序，也分为部分基因测序，如16s RNA（线s rDNA或ITS区域测序）基因测序，和全基因测序两种。

  rDNA既有相对保守区，也有突变频率较高的可变区，结合PCR技术及Sanger测序或NGS测序得到这部分序列信息，进而进行对库比较，可以鉴定菌种到属种。这种方法费用较低，速度快（1-2天），结果准确可靠。

  如果要鉴定菌株，或者对多次传代后的重要菌种进行质量鉴别判定，则需要对菌株全基因组进行测序，并对测序结果进行生物信息学分析。这种方法信息全，数据多（可用于其它分析），费用略高，周期略长（1-3周，根据基因组大小、测序深度要求及数据分析要求而定）。

  微生物的质谱鉴定是一种基于细菌全细胞蛋白质组指纹图谱分析的技术，需要通过专门的数据库和自动分析系统对未知细菌的特殊蛋白图谱与菌种文库中收集的菌种蛋白质组指纹图谱作比较。由于微生物质谱分析的蛋白质大分子适合于飞行时间质量分析器，因此，微生物的质谱鉴定被统称为基质辅助激光解吸电离的飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）。参考资料：中华人民共和国国家标准 GB/T 33682--2017 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则

  质谱鉴别微生物，具备快速，高通量，简单易操作，结果重复性好等特点，在临床感染微生物诊断中有重要的意义，也发展非常迅速。国内体外诊断厂商也有好几家在这一领域发力，推出了一些基于质谱的微生物鉴定系统。

  细菌鉴定的靶标是 16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因序列。16s rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16s rDNA就是编码该亚基的基因。

  细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rRNA。16s rDNA是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。

  16s rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，素有“细菌化石”之称。具备以下特征：

  （1）都会存在；16S rRNA 都会存在，因此可用于研究所有细菌之间的系统发育关系；

  （4）在基因结构与功能上具有保守性，结构上又包含有9个可变区（variable region，V1-9）能体现不同种属的差异，也包含10个保守区（constant region）给扩增引物设计及数据分析带来极大的便利。

  因为上述特点，16s rDNA是细菌种属鉴定的理想靶标。研究者能够准确的通过课题情况，选择对16S rDNA基因的前 500 bp或完整的约1,500 bp长度测序。前500 bp涵盖16S基因9个高变区中的3个，能够很好的满足常规鉴定需求。

  在某些情况下，500 bp区域不足以区分非常紧密关联的细菌，因此就需要信息量更大的16s rDNA全基因读取。另外，在描述新物种时，需要对整个 1,500 bp 序列进行测序。

  16S rRNA基因中的高变区。细菌16S基因内有9个高变区，以红色表示。保守区域用蓝色表示。

  以上图表为16s rDNA常用引物（待核实推敲），根据实验要选择组合；也能够准确的通过16s rDNA保守区域序列自行设计。

  线s rDNA同样包含保守区和可变区（V1-V9，没有V6区），18s rDNA是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，适用于种级及以上的分类标准，也是真核微生物基于测序办法来进行种属鉴定常用的靶标区域。其中，V4区使用最多、数据库信息最全、分类效果最好，是18s rRNA基因分析注释的首选选择。由于18s rDNA在进化速率上比较保守，因此在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA 18S、5.8S及28S之间，由于承受的选择压力小，在进化过程中可承受更多的变异，其进化速率为18s rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。另外，也可通过选择引物同时扩增18s rDNA和ITS，通过一系列分析18s rDNA序列，先在较高级别上确定样品的归属，然后根据ITS 序列，将真菌归类到种或亚种水平。

  对于真核微生物物种鉴定，基于测序的方法，常选择18s rDNA + ITS区域作为基因组的靶区域进行序列数据获取和分析，从而得到更精准的物种分类信息。

  对菌落用NGS平台做全基因组测序，是菌种鉴定的终极解决方案。可以鉴定到菌株。此外，全基因组信息，还能够最终靠生信分析，得到更多的信息，比如GO、Pathway等。对于有潜在重要价值的菌株，全基因组序列数据基本上也是必备数据之一，是对微生物进行基础研究的重要手段之一。

  附带提一下，宏基因组测序，能够获得群落中的大部分菌株的基因组信息（丰度太低则有可能得不到信息）。如果要得到菌株信息，还有必要进行分离培养再做全基因组测序。

  无论用哪种办法来进行菌种鉴定，数据库的容量和质量，都是很重要的方面，还可以决定一个方法有没有生命力。

  当然，方法的生命力和数据库的容量和质量，是相辅相成的两个方面。一个菌种鉴别判定的方法可靠易用，那么用的人就多，相应的数据库的容量和质量就有基础，并对方法的应用起到重要的支撑作用。

  目前应用最广的分子生物学数据库，是NCBI的genebank，无论是rDNA，还是全基因组测序的结果，基本上首选是对NCBI数据库作比较和分析。这是美国占领生物技术高地的基础设施的一部分，且地位日益稳固。

  EzBioCloud由隔壁韩国CJ Bioscience公司建立和维护，是保持数据库更新的公共数据分析的门户网站，专注于细菌和古菌的分类学，生态学，基因组学，宏基因组学和微生物组。包括生物信息学工具，并继承了以前的数据库，包括EzTaxon, EzTaxon-e和EzGenome。EzBioCloud网络已在50多个不同的国家被超过22,000名用户使用，包括学术界，非营利研究组织，医学界，政府机构和全球公司。

  3，每个推出相应菌种鉴别判定的方法的公司，都会自己建立相应的数据库（没有数据库支撑就没有用户买设备和试剂）。质谱领域基本是这个模式。

  近年来，我国对于微生物资源重视程度也在日益增加，国家菌种资源库（以下简称菌种库）以原国家科委指定相关部委设立的国家级专业菌种保藏中心为基础，2002年开始组建，2011年成为科技部、财政部首批认定的23家国家科学技术基础条件平台之一，2019年优化调整定名。

  希望国内有机构持之以恒的建设高质量和广泛接受度的微生物乃至全物种基因数据库。这是现代生物学重要的基础设施之一。

  另外，生物信息学分析，在现代生物技术包括菌种鉴别判定技术中，也发挥着逐渐重要的作用。干湿结合是方向和必需，干实验，湿实验同等重要，互相补充。

  微生物研究与检测在生产生活及疾病诊疗方面发挥着逐渐重要的作用，且未知微生物种类及研究价值也潜力巨大，菌种鉴别判定技术应用会愈来愈普遍。作者觉得，在科研领域，基于测序的菌种鉴定方法会是主流，而临床诊断类的应用，基于质谱的菌种鉴定会更适合临床需求。

  奥科生物具备成熟的Sanger测序，NGS测序及生信分析平台，在基于测序的菌种鉴定及数据分析方向有较强的技术实力及很丰富的技术服务经验，可以为生命科学研究和开发工作者提供通用或个性化的专业方面技术服务。